BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE 03

São a base fundamental para obtenção de resultados em genética molecular

01)Isolamento do DNA de interesse, para isso vamos usar enzimas de reestrição, que são enzimas que vão cortar o meterial genético, em pontos expecíficos para poder selecionar aquele gene de interesse que eu quero manipular 02)Vetores de clonagem:amplifica a quantidade desse gene para poder estudar 03)Introdução do DNA em uma célula hospedeira 04)Aplicação desse gene de interesse para obtenção de um produto expecífico

São enzimas que cortam expecificamente os genes expecíficos para o projeto

-DNA alvo -Antes de iniciar, é preciso conhecer o gene da fluorescencia, conhecendo as sequências de bases nitrogenadas

-Usando a eletroforese, separa o DNA com base no tamanho -Como o DNA tem fosfato em sua composição, e esse tem carga negativa, assim serã separados com base no tamanho -Usando a eletroforese, que é um equipamento, aqui colocamos o gel, até formar uma gelatina mais durinha, a eletroforese tem um polo positivo e um negativo, vc vai colocar os fragmentos de DNA do tubinho que vc pegou, vai colocar eles do lado negativo, porque o DNA corre por atração para o lado positivo -Vão começar a ser atraídos pelo polo positivo, e os fragmentos que forem mais pesados, vão andar menos, vão atrair menos, e os mais leves vão atrair mais -Ao fazer a leitura é possivel observar

-É utilizado uma sonda, que na verdade é uma seguência de nucleotídeos complementar a seguência do gene da fluorescencia por exemplo -Essa sonda vai ligar no fragmento do meu gene de interesse -Ai os fragmentos que se ligarem nessa sonda vão ficar marcadas fluorescentemente

-Não vamos conseguir colocar o DNA alvo que é o gene da fluorescencia e inserir no orgamismo alvo, no suíno por exemplo, é preciso ter um veículo para transportar esse material genético -Vamos precisar ligar esse material genético em um material genético que consiga ser inserido do suíno sem que ele regeite isso, isso é chamado de transformação -Então vamos ligar o gene em outro DNA, que tenha capacidade de ser inserido no organismo suíno -Após isso ainda é necessário potencializar esse DNA, chamado de clonagem -Para isso usamos os vetores de clonazem, que é uma molécula de DNA que por exemplo um plasmídeo que está presente em alguns organismos que tem uma capacidade de transportar o DNA para dentro de uma célula hospedeira -Plasmídeo: normalmente é um DNA circular, tem uma alta capacidade de captar a maioria dos DNA alvo que desejos inserir, e tem a capacidade de se inserir em um organismo alvo, plasmídeo de E.coli por exemplo -Então o plasmídeo é capaz de trasportar o gene da fluorescencia para dentro da nossa célula hospedeira, mais facilmente -Após integrar ele em organismos para que ele possa se multiplicar e ai sim colocar no porco

Adicionando ele ao plasmídeo bacteriano, como por exemplo da bactéria E.coli, após vamos cultivar esse bacteria para que se multiplique e crie diversas cópias não só do seu material genético como tambêm do plasmídeo

01)Extrair o DNA da água viva 02)Localizar o gene de interesse (Fluorescencia) 03)Cortar com enzimas de reestrição com a maior número de fragmentos que contenham esse gene da florescencia 04)Fazer a leitura disso em um gel de agarose, para ver se os fragmentos foram cortados 05)Para identificar o gene da fluorescencia vou colocar em southern blot porque dai eu vou conseguir marcar radiotivamente aquele gene para saber que ele está ali 06)Pegar esse gene da fluorescencia e colocar ele em um plasmídeo, porque o plasmídeo eu consigo inserir em uma bactéria, e quando ela passa a se multiplicar ela multiplica tbm o meu DNA de interesse 07)Vou extrair o gene de interesse das bacterias que agora está em uma quantidade infinitamente maior, e colocar no animal, que não é no animal adulto, e colocar ele no núcleo de um embrião, e por inseminação e outros procedimentos eu vou conseguir ter um animal transgênico 08)Como saber se deu certo, o porque da esquerda tem o fucinho e as patas amarelas já o da direita é um porco normal

Envolve o estudo e a manipulação das moléculas que constituem o material genético dos organismos

Sim

São proteínas bacterianas que vão cortar moléculas de DNA em regiões específicas

Mais de 800 enzimas

É o padrão único de corte de cada enzima específica

São os trechos de DNA em que são iguais se lidos ao contrário

A) 01)Processo de replicação onde na mitose é realizado uma cópia idêntica, enzima helicase rompe as pontes de hidrogênio da fita dupla, proteínas chamadas SSBs mantém as fitas separadas, a topoisomerase impede que o DNA fique superenrolado, a enzima primase adiciona um trecho de RNA chamado de primer, que serve como ponto de partida, enquanto isso a DNA polimerase adiciona os nucleotídeos, já que as fitas originais são antiparalelas, a DNA polimerase só consegue sintetizar no sentido 5 linha 3 linha, então faz o sentido inverso em uma delas, enquanto os fragmentos de okazaki sintetizam na fita retardatária os fragmentos, que depois serão ligados pela enzima ligase. 02)Processo chamado de transcrição, onde o DNA forma um RNA mensageiro contendo as informações para síntese de proteínas, ocorre da seguinte forma, a RNA polimerase se liga em uma região promotora de DNA onde vai iniciar, o DNA se desenrola localmente expondo a fita molde, aquela no sentido 3 linha 5 linha, a RNA polimerase adiciona nucleotídeos, até encontrar uma sequência de término, o RNA recém formado é finalizado, logo após ainda não pode servir para síntese de proteínas, ainda passa por processos de proteção da informação genética, como a adição de 5 linha, e cauda poli-a, e splicing. 03) Processo chamado de tradução, onde o RNA mensageiro vai transmitir ao RNA transportador as instruções para que o RNA ribossômico sintetize a proteína. B)O processo de transcrição onde o DNA por meio de diversas enzimas, realiza uma cópia inversa de seus nucleotídeos formando um RNA, que pode ser RNA mensageiro, RNA transportador e RNA ribossômico. O RNA mensageiro é o que leva a informação genética do DNA até o ribossomo, que pode estar fora do núcleo, no caso até o citoplasma, onde ele realiza essa mediação, para que seja realizada a síntese da proteína. O RNA transportador, é quem carrega os respectivos aminoácidos requisitados de acordo com a trinca de códons, fazendo a tradução do RNA mensageiro, ele leva esses aminoácidos ao RNA ribossômico, encaixando na sequência de bases nitrogenadas na sequência Adenina = Timina, Citosina = Guanina quando isso ocorre no RNA a Adenina se liga na Uracila. O RNA ribossômico recebendo esses aminoácidos, vai montando a sequência estrutural da proteína. C) 01) Em eucariontes a síntese de proteínas é realizada no citosol. 02) A sequência UGG especifica o triptofano.

5 linha 3 linha, que são as extremidades que ficam livres para fazer ligação com outros nucletídeos

É um corte feito de forma assimétrico

- Extremidade cega, quando o corte é simétrico e não ficam os nucleotídeos livres - Extremidade coesiva é quando vai ter ali a enzima de restrição e o corte formando a fita simples, que vai ter ali as enzimas livres

- Vão surgir vários fragmentos, após a ação da endonuclease, ou das enzimas de restrição - Como saber se a região de interesse que queríamos cortar, vai estar ali naquela solução - A través da técnica de eletroforese em gel -É um método que auxilia na determinação das quantidades de fragmentos gerados após a ação da enzima e no tamanho dos fragmentos -Princípio da eletroforese em gel, é separar moléculas com base no tamanho e carga elétrica -Conforme o peso molecular, as moléculas maiores elas vão ficar mais na região inicial, não vão conseguir migrar facilmente pela malha do gel (porinhos) - Porque moléculas menores correm mais na direção positiva? - Porque a constituição das unidades básicas do DNA são os nucleotídeos, grupo fosfato + açúcar + base nitrogenada, devido a carga do grupo fosfato que é negativa, então os fragmentos vão em direção a carga positiva, porque positivo atrai carga negativa

- É formado por uma rede de tramas de poros microscópicos - O gel de agarose ele vem em pó, é adicionado a uma solução para diluir, é colocado na placa para endurecer, e ai o pente para endurecer com os poços do pente - Existem 2 tipos de eletroforese, a vertical, que normalmente é utilizada para proteínas e a horizontal usada para DNA e RNA, mas em ambas usamos o tamanho e a carga elétrica para fazer a separação

- As partículas serão reparadas de acordo com a sua carga e peso molecular

-Não, ainda é necessário o uso de um corante específico para visualizar - Um corante muito usado é o brometo de etídio, porém ele tem muitas limitações, é muito tóxico e mutagênico, potencial cancerígeno

Separar a fita dupla

Para conseguirmos ter o sítio da região alvo, para poder fazer um DNA recombinante, que é a junção de dois materiais genéticos que podem ser de espécies diferentes

-Replicando através de vetores de clonagem -O DNA da bactéria é separado do plasmídeo que é um DNA circular, que ele não está junto ele fica separado do DNA da bactéria -O DNA humano vai ser incorporado no plasmídeo, dando origem ao DNA recombinante -Esse DNA recombinante vai ser adicionado em um meio de cultura com todos os nutrientes para essa bactéria se desenvolver, toda vez que ela for se replicando esse DNA recombinante vai replicando, e essas bactérias são cópias do gene humano

- É transferido o DNA recombinante para o interior de um hospedeiro no caso da bactéria -Pode ocorrer de forma natural ou sintética -A limitação é 1000 pares de bases que é a unidade ali dos fragmentos da eletroforese

- A insulina recombinante, que é sintetizada pela inserção do gene da insulina na bactéria, E.Coli, que após é passada por uma processo de purificação, depois da bactéria se reproduzir bastante, ela vai ser lisada, essa insulina vai ser testada para comprovar a sua eficácia

DNA recombinante

Sim

É uma técnica que permite a edição de um gene do DNA, foi desenvolvida graças a observação da guerra das bactérias contra os vírus, os vírus inserem material genético dentro das bactérias, para enfraquecerem elas, algumas vezes essas bactérias conseguem resistir, graças a um sistema antivírus só delas, a bactéria salva parte do DNA do vírus dentro de seu próprio DNA, e com a ajuda de uma proteína consegue edita-lo para se salvar, os cientistas descobriram como funciona esse truque, e aprenderam a repetir em laboratório, com isso podem editar DNA de plantas, animais e até seres humanos, é possível mudar uma única letra em centenas de milhares, já testado no HIV, provou que é possível reduzir o material viral dentro das células brancas do sangue, tem potencial para acabar com tumores dos mais variados, e problemas genéticos como daltonismo e síndrome de dalton, com o crisper podemos editar a cor dos olhos do bebê, da pele, e ter bebes sempre saldáveis.

- Temos as tesouras que são as enzimas de restrição, no caso as Cas9 - As coordenadores de GPS o RNA guia - Local de corte que vai ser ali PAM onde acontece o corte - E a fixação que é o modelo de reparo (Modificado) - Como curiosidade nasceram em 18 as primeiras gêmeas transgênicas, que são imunes ao vírus do HIV