BIOLOGIA MOLECULAR FORENSE 04

Sim, é um processo chamado de transcrição, e a partir dele podemos formar as proteínas

Serve para amplificar as seguências de DNA e ela também pode ser considerada ferramenta principal para entender várias doenças entre elas o vírus da covid 19 que pode ser diagnosticado atrávez dessa técnica

Em 1983, por Kary Mullis, e a técnica permite que façamos fragmentos desse DNA de interesse, amplificado milhões de vezes, essa amplificação acontece naturalmente no nosso corpo, mas conseguimos fazer essa replicação artificialmente atravéz da tecnologia de PCR, é uma tecnologia rápida, totalmente automatizada, usa uma série de reagentes que vão ser agrupados, somados e colocado em um equipamento expecífico que vai conseguir fazer a amplificação desse DNA, e depois vamos verificar o resultado da amplificação

01)Extração do DNA, é feita atrávez de kits que são comprados em laboratório 01.01 coletar o material, pode ser sangue periférico, mucosas 01.02 administrar detergentes ou glicose ou nitrogenio líquido para quebras as paredes celulares das membranas das células da amostra 01.03 quebra ou lise do núcleo para liberar o DNA , através da administração de uma solução tampão que vai conter enzimas que vão promover a degradação e liberação do núcleo 01.04 Purificar para obter apenas o DNA 02)Submeter a amostra a altas concentrações de sais, que vão inibir a formação de dupla fita, impedindo a adesão do DNA fique preso em restos celulares, se recombinando outras porções da célula que agora estão rompidas 03)Faz uma solução de solvente orgânico, que vamos juntar com essa amostra e vai submeter ela a uma centrifugação, vai fazer com que o DNA ou RNA se separe do restante das amostras, depois disso vai lavar esse material, e centrifugar novamente, para que aja uma purificação da amostra, ai o DNA se precipite, retirar com etanol todo esse escedente que ficar na amostra com etanol 04)Ficando apenas o DNA no tubo, vamos levar esse material para secagem, em temperatura ambiênte, adiciona um tampão para fazer a resuspenção desse material, ai armazena o material, caso não queira atilizar ele no momento, no freezer por mais ou menos -20 graus por meses e anos 05)Vamos precisar misturar com a amostra nesse tubo alguns componentes: solução tampão (gatantindo condições de ph adequadas, que vão mimetizar as condições naturais), adicionar nucleotídeos, que contenham adenina, guanina, citosina e timina, ao DNA que queremos amplificar, adicionar enzimas como a Taq-polimerase para fazer a adição dos nucleotídeos, porque quando o processo ocorre naturamente no nosso corpo e necessário todos esses requisitos para a replicação ocorrer, naturalmente temos a DNA polimerase, bases nitrogenadas, condições de ph e temperatura, para começar precisamos das seguências iniciadoras, por isso também entram os primers 06)Após as misturas ordenadas, misturar os reagentes e encaminhar eles para o termo ciclador, que é o equipamento que faz a amplificação artificial

-Levar a amostra para o termociclador, e ajustar as temperaturas desejadas, e quantos ciclos de replicação vc quer no computador e dar iniciar -Dentro do termociclador, o que ocorre, na primeira etapa esse DNA que está isolado, vai se desnaturar, pelo aumento da temperatura, para que haja separação das fitas. -Depois que separou as fitas imediatamente ocorre o resfriamento para que possam ser adicionados os chamados primers, que são os iniciadores, porque a dna polimerase ela não consegue fazer a leitura em um DNA de fita simples, quando separamos, vai ter 2 fitas simples. tem que ter uma base de fitas duplas, os primers, vão entrar agora nesse porto, vão se ligar aos segmentos iniciais nas extremidades para que a dna polimerase possa se ligar e iniciar a replicação, agora ela vai deslizar sobre essas fitas de DNA, adicionando esses oligonutreotídeos, adenina, quanina, timina processo chamado de hibridização

-Vc vai precisar visualizar o que ocorreu no tubo, ver se foi amplificado, utilizando o transiluminador, vamos visualizar a amostra, ele tem 2 polos, é uma placa, onde dentro vc coloca um gel, gel de agarose, tem buraquinhos de um dos lados, onde vc pinga a amostra -Tem dois polos, negativo e positivo, e o DNA é eletricamente negativo, e ele vai tender a correr p lado positivo -Fragmentos mais pesados vão tender a andar menos, e fragmentos mais leves vão tender a chegar mais rápido no polo oposto, e com isso vc consegue ler, por meio de pares de bases, é utilizado também a amostra de controle, chamada de marcador, que é um reagente que tem algumas pares de bases

-Vc deve saber previamente qual é a parte do DNA que vc quer sequênciar, porque vc tem que comprar o primer (iniciador) que fica antes do gene, para que a DNA polimerase possa se ligar ali, e amplificar a sequência que eu quero -Alta probabilidade de contaminação -A DNA polimerase serve tanto para adicionar nucleotídeos, quanto para corrigir nucreotídeos que poss ter sido adicionados erroneamente, então a taq-polimerase que compramos não consegue fazer uma boa correção desses nucreotídeos que foram adicionados incorretamente, podendo ocasionar em erros de replicação -Limitação do fragmento que vou amplificar, não consigo replicar um DNA que seja muito grande, não pode ultrapassar 50 mil pares de bases

-PCR quantitativa ou em tempo real -É uma atualização da convencional, possui uma sensibilidade um pouco maior -Faz a captação de florescência, o resultado acaba sendo mais significativo, tem leitura automatizada

-Consegue ver regiões diferentes do DNA ao mesmo tempo, é possível trabalhar com multiplos DNA -Resultado mais rápido

-Usa como reagente o resulta da PCR convencional

-Foi utilizada para o covid 19, serve expecificamente para amplificação de RNA -É realizado a coleta da amostra, essa amostra contendo o sars cov 2, vai fazer a extração do DNA, colocar os reagentes,e associado a isso a transcriptase reversa -Também é feito a análise atravéz de softwares

Através da descoberta de James Watson e Framcis Crick em 1952, que decifraram a estrutura da molécula de DNA contida no interior das nossas células

É composto por um grupo fosfato, e um carboidrato, que pode ser ribosse no caso do RNA ou desoxiribose no caso do DNA e uma base nitrogenada, que pode ser adenina, guanina,citosina ou timina, É composto por um grupo fosfato, e uma proteína, que pode ser ribosse no caso do RNA ou desoxiribose no caso do DNA e uma base nitrogenada, que pode ser adenina, guanina,citosina ou timina

Citosina: presente tanto no DNA quanto RNA (liga a guanina) Tiamina:exclusiva do DNA no RNA é substituída por Uracila (liga na Adenina) Uracila:exclusiva do RNA substitui a Tiamina (liga na Adenina)

Adenina: emparelha com timina do DNA e uracila no RNA Guanina: emparelha com Citosina

os nucreotídeos das duas fitas se ligam entre sí por ligação fosfodiéster, as ligações entre os nucleotídeos da fita acontevem entre o carbono 3 do carboidrato (desoxirribose) e o grupo fosfato do outro nucleotídeo, localizado no carbono 5, ou seja a ligação vai 3 linha 5 linha, dessa forma, as duas fitas ficam dispostas de forma antiparalela, identificadas um 5-linha-3linha e a outra 3-linha5linha

Porque ao ligar as duas fitas é realizado uma torção voltada para o lado direito, para isso é preciso ligar as fitas entre si, nesse caso, as bases dos nicleotídeos de cada uma das fitas se associam por intermédio de uma ligação denominada "ligação de hidrogênio".

É o processo onde o DNA replica o seu material genético, formando material suficiênte para duplicação da célula

01)A helicase faz a divisão das fitas, quebrando de forma gradual as ligações de hidrogênio 02)A DNA polimerase adiciona os nucleotídeos complementares a cada uma das fitas, para adicionar os nucleotídeos a polimerase precisa que uma pequena sequência de nucleotídeos seja adicionada às fitas modelos, que é feita pela 03)Primase que é expecializada em adicionar esses primers 04)Como a DNA polimerase tem capacidade de adicionar nucleotídeos para formar a bova fita apenas na leitura 3-5 linha da fita modelo, temos o problema da fita que vai do 5-3 linha, que pode ser corrigido com adição de vários primers, permitindo que seja feito a leitura de tráz p frente, sendo assim a síntese da molécula do DNA é feita de maneira contínua de tráz p frente, formando fragmentos denominados "fragmentos de Okasaki" 05) Os fragmentos separados na fita contínua, no final da replicação, não unidos por uma proteína chamada DNA ligase, contudo antes, são retirados os primers de RNA, por uma nuclease e adicionado o DNA subsequente pela POLIMERASE DE REPARO 06) a Topoisomerase, se posiciona na extremidade oposta da helicase, a medida que a helicase abre a fita em uma das extremidades, na oposta, a topoisomerase se associa, a fim de diminuir a tensão e impedir o superenrolamento do DNA 07) Proteínas ligadoras impedem que a fita de DNA separada volte a se associar 08)a proteína Grampo deslizante mantêm a DNA polimerase presa ao molde a medida que há a sistese da fita nova

- Exames pré-natal -Diagnóstico de doenças - Detecção de microrganismo no ambiente

São os passos que o DNA procede, a fim de transmitir a informação final, que é a produção de RNAs e proteínas, eventos como Replicação, Transcrição e Tradução

Quando a replicação ocorre fora do corpo, de forma artificial

- Quando ocorre a amplificação do material genético, de uma sequência em específico, região alvo, que vão gerar várias cópias do material genético, isso é importante quando temos pouca amostra original, precisamos aumentar a quantidade da amostra de DNA, -Significa reação em cadeia da polimerase -Na área forense se eu tenho pouco material genético, é preciso amplificar/aumentar esse material -Na desnaturação é para separar a dupla fita de DNA - No anelamento dos primers (Pequenas fitas iniciais de RNA para Taq-polimerase iniciar a duplicação, usada como fita molde) - De uma fita dupla formam 2 fitas duplas, no primeiro ciclo - A PCR permite que os fragmentos de DNA sejam amplificados um bilhão de vezes em poucas horas e é caracterizado como uma técnica rápida, totalmente automatizada e sem a necessidade de uso de células

- Amostra da região do DNA de interesse para amplificar - Extração do interior da célula, de maneira íntregra e pura, a fim de garantir um bom resultado na PCR -> Kits comerciais - Possui 2 fazes importantes, lise ou quebra da membrana celular, para liberar o DNA e posteriormente a purificação - Componentes para a PCR (ingredientes)

- São usados detergentes específicos para agredir a membrana da lipoprotéica da célula para expor o DNA, junto com a solução tampão - Após isso é centrifugado o material, porque o sangue vai lá para o fundo, e em cima o sobrenadante que seria o diluente usado - Após usamos o etanol que vai precipitar o DNA e eliminar impurezas - Por último ocorre a purificação do DNA - É possível visualizar, no tubo, um pellet, o qual varia do transparente ao branco. Em seguida, é retirado o etanol e o tubo contendo o DNA é levado para a secagem em temperatura ambiente. Após a secagem, é adicionado um tampão (TE: tris+ EDTA) para ressuspensão, o que permite que o material seja armazenado em freezer por - 20ºC por meses ou até anos - A obtenção de ácidos nucleicos de alta qualidade é essencial, visto que promove o sucesso das etapas seguintes da PCR. DNA - A PCR é um processo artificial de replicação do DNA. - Como é possível reproduzir o ambiente celular e as reações fisiológicas em sistema automatizado?

- Enzimas, como a Taq-polimerase (DNA polimerase), que adicionará os nucleotídeos na formação da fita. DNA • Solução-tampão para garantir o pH e concentrações iônicas adequados à reação. • Artifícios de variação de temperatura que o termociclador fará e que o organismo realiza naturalmente em condições fisiológicas.

- Na etapa 02 é possível observar a ligação dos oligonucleotídeos iniciadores - Etapa2–Anelamento: • Ocorre a hibridização dos oligonucleotídeos iniciadores. DNA • Inicia a síntese do segmento do DNA desejado - Etapa3–Extensão Os quatros desoxinucleotídeos trifosfato (contendo o grupamento fosfato, açúcar e uma das bases nitrogenadas- A, T, C e G) são adicionados e o segmento de DNA selecionado pelos iniciadores é replicado de modo seletivo. - É um processo semiconservativo, sempre vai ter fita molde que é a original

- Diferente da DNA -Polimerase, a Taq-polimerase não é capaz de fazer correções de nucleotídeos adicionados de forma incorreta

- Em reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa- RT-PCR, como trabalha com RNA faz a transcrição reversa, forma um DNA que se deriva do RNA - PCR em tempo real é quantitativa

-É realizada por meio de captação de fluorescência - É em tempo real porque de acordo com que vai realizando a PCR o gráfico vai sendo construído - É constituida pela baseline, que é a linear debaixo que não começou a amplificação - Faze exponencial que tem a máxima de amplificação do DNA - Faze linear que é onde já foi consumido todos os reagentes - Platô Quando consumido todos os reagentes é terminado a leitura

- É possível colocar várias amostras de uma vez - A temperatura de anelamento deve ser semelhante - Os diferentes fragmentos de DNA devem ser de tamanhos diferentes

- Fazemos a PCR convencional e o produto dessa PCR usamos para fazer a Nested PCR - Tem menos chances de anelamento em sequências inespecífica - É uma técnica muito específica, detecta exatamente o fragmento de interesse

- Diferente das outras PCR a amostra fornecida possui RNA como ácido nucléico a ser amplificado, agora queremos amplificar o RNA - Temos o material genético que é de RNA, é preciso fazer um DNA a partir dessa fita simples, é feito isso através da ação da transcriptase reversa, essa enziam vai permitir que através de uma molécula de RNA eu consiga formar uma de DNA e essa molecula vai ser chamada de DNA complementar - Essa técnica que foi usada para detecção do vírus do covid 19, é padrão ouro

- O DNA era amplificado a partir do RNA viral, para poder realizar a detecção do vírus