PCR

30問 • 1年前

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問題一覧

DNAの"増幅"に用いる機械

サーマルサイクラー

DNAの"分離"に用いる機械

アガロースゲル電気泳動装置

PCRに必要な試薬

Taqポリメラーゼ, Mg2+, プライマー, dNTP, 対象DNA

PCRの試薬 DNA鎖の合成に必要。

Taqポリメラーゼ(耐熱性DNAポリメラーゼ)

PCRの試薬ポリメラーゼの活性に必要

Mg2+(MgCl)

PCRの試薬ポリメラーゼが働く開始点の指定

プライマー

PCRの試薬 DNA複製の鋳型となる

DNA

PCRの試薬 DNA合成の材料

dNTP

PCRの手順

熱変性, アニーリング, 伸長

PCRの温度変化大体の温度を順番通りに答えよ

90℃, 50〜60℃, 70℃

DNA,RNA濃度・純度測定 A260nmが大だと、純度は(１)。 A280nmが大だと、純度は(２)。

大, 小

アニーリング Tm値は、(１)の公式で解く。

2×(A+T)+4×(C+G)

アニーリング温度設定は、(１)温度である。

Tm値より2〜5℃低い

アニーリング Tm値が(１)と特異性が高くなる

高い

プライマーの種類

フォワードプライマー, リバースプライマー

アニーリングプライマーは2種類あり、"フォワード"プライマーは伸長方向が正のもの。結合する時はそのまま。 "リバース"プライマーは、伸長方向が逆のもの。結合するのは、(１)→(２)にしてから探す。

順番を後ろから前に、つまり逆向きにする, AをTに、その他も然り対応する塩基配列にする

プライマー濃度一般に(１)が最適である。

0.1〜0.6μM

プライマー標的DNA配列にアニーリングできるものを選べ

オリゴヌクレオチド, ポリヌクレオチド

PCRの特異性はプライマーの(１)側配列により決定される

最適プライマー 3'末端が(１)や(２)の場合、増幅が起こらない可能性がある。特に(２)。

A, T

プライマーの塩基配列 GC含有量を(１)前後にする。

40%

伸長 (１)方向に相補鎖を合成する。

5'→3'

伸長増幅反応は(１)前後で行う。

30サイクル

定量PCR法では標的DNA量が多いほど、Ct値が(１)。 ※Ct値＝サイクル値

小さい

PCR増幅産物の検出 (１)電気泳動で行う。 DNAは、目に見えないため、(２)などの試薬を用いる。(２)はDNAと結合し、紫外線を照射することで蛍光を発する。

アガロース, エチジウムブロマイド

増幅産物サイズが(１)ほど増幅効率が良い。

小さい

PCR増幅産物の検出アガロースは網目構造になっているため、(１)ほど"早く遠く"に行く。 DNAは(２)に帯電しているため、その逆方向に向かって流れる。

小さい, -

PCRトラブルシューティングネガティブコントロールとポジティブコントロールを検体として同時に解析する。 NCが陽性になるのは、PCR反応液が(１)している場合である。

コンタミネーション

PCRトラブルシューティング非特異的なバンドが認められた場合

サイクル数を減らす, Mg2+の濃度を下げる, サンプル量を減らす, プライマー量を減らす, アニーリング温度を上げる

PCRトラブルシューティング目的バンドが認められない場合

サイクル数を増やす, Mg2+の濃度を上げる, サンプル量を増やす, プライマー量を増やす, アニーリング温度を下げる

英語

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テスト

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Mg2+(MgCl)

PCRの試薬ポリメラーゼが働く開始点の指定

プライマー

PCRの試薬 DNA複製の鋳型となる

DNA

PCRの試薬 DNA合成の材料

dNTP

PCRの手順

熱変性, アニーリング, 伸長

PCRの温度変化大体の温度を順番通りに答えよ

90℃, 50〜60℃, 70℃

DNA,RNA濃度・純度測定 A260nmが大だと、純度は(１)。 A280nmが大だと、純度は(２)。

大, 小

アニーリング Tm値は、(１)の公式で解く。

2×(A+T)+4×(C+G)

アニーリング温度設定は、(１)温度である。

Tm値より2〜5℃低い

アニーリング Tm値が(１)と特異性が高くなる

高い

プライマーの種類

フォワードプライマー, リバースプライマー

順番を後ろから前に、つまり逆向きにする, AをTに、その他も然り対応する塩基配列にする

プライマー濃度一般に(１)が最適である。

0.1〜0.6μM

プライマー標的DNA配列にアニーリングできるものを選べ

オリゴヌクレオチド, ポリヌクレオチド

PCRの特異性はプライマーの(１)側配列により決定される

最適プライマー 3'末端が(１)や(２)の場合、増幅が起こらない可能性がある。特に(２)。

A, T

プライマーの塩基配列 GC含有量を(１)前後にする。

40%

伸長 (１)方向に相補鎖を合成する。

5'→3'

伸長増幅反応は(１)前後で行う。

30サイクル

定量PCR法では標的DNA量が多いほど、Ct値が(１)。 ※Ct値＝サイクル値

小さい

アガロース, エチジウムブロマイド

増幅産物サイズが(１)ほど増幅効率が良い。

小さい

小さい, -

コンタミネーション

PCRトラブルシューティング非特異的なバンドが認められた場合

サイクル数を減らす, Mg2+の濃度を下げる, サンプル量を減らす, プライマー量を減らす, アニーリング温度を上げる

PCRトラブルシューティング目的バンドが認められない場合

サイクル数を増やす, Mg2+の濃度を上げる, サンプル量を増やす, プライマー量を増やす, アニーリング温度を下げる