1) ampicillin 용액 1mg/ml를 전처리한다, 2) 마이크로피펫으로 ampicillin과 아세토나이트릴을 채취해 각각 0.05, 0.025, 0.0125mg/ml로 희석한다, 3) 각각의 희석용액을 유리바이알에 500ul씩 넣고 미지시료도 유리바이알에 500ul을 넣는다, 4) 유리바이알들을 오토샘플러에 넣어준다, 5) HPLC프로그램을 실행한다(펌프,오토샘플러,컬럼,디텍터 초록불 기다리기), 6) 분석조건을 설정하고 저장한다 1. 펌프 flow : 1ml/min solvent : AN 90%, 물 10% 2. 오토샘플러 injection volume : 10ul 3. 컬럼 온도 : 40’C 4. 디텍터 최대흡수파장 : 254nm, 7) 컬럼에 공급해 분석을 시작한다, 8) peak arear값을 얻고 이를 토대로 검량선을 그려 미지시료의 농도를 알아낸다

ampicillin용액속의 불순물을 제거하기위해서, 컬럼의 내부는 다공성으로 되어있는데 불순물이 존재하면 컬럼의 내부를 막아 컬럼을 손상시키고 장비의 수명을 떨어뜨린다, 불순물로 인해 데이터해석이 어려울수도 있다

다양한 시료의 물리,화학적 특성을 분석하기 위해, 결정, 물질의구조, 물질의물성, 물질의형태, 무정형, 열적변이 (결구물형, 무열)

다양한 물질을 성분별로 분리하여 함유량 즉 정량 및 정성분석을 하기 위해

1) 메뉴얼컬럼 : 63~200um 크기의 불균일한 입자의 레진으로 구성, 분리도가 떨어진다, 2) HPLC컬럼 : 3~5um 크기의 균이한 입자의 레진으로 구성, 분리도가 높다, 레진의 입자크기가 작다 -> 컬럼의 내부압력이 증가한다 -> 물질분리효율이 증가한다 -> HPLC는 액체의 이동상을 이용해 물질의 높은 분리를 수행한다

1) 마이크로 입자크기의 다공성으로 이루어진 실리카레진으로 구성되어있다, 2) 컬럼의 길이가 길면 분석시간이 증가하고 분리효율이 증가한다, 3) 컬럼의 길이가 짧으면 분석시간이 감소하고 분리효율이 떨어진다, 4) 컬럼의 직경이 크면 한번에 주입할 수 있는 시료의 양이 증가한다, 5) 컬럼의 직경이 작으면 높은 민감도를 갖는다

용매가 물질을 컬럼 밖으로 밀어내는 힘

용리력이 큰 용매만 사용하면 실험시간이 짧아 관측이 어렵고 용리력이 작은 용매만 사용하면 실험시간이 길다. 따라서 두 용매를 적당히 섞어 실험시간을 적당하게한다, 단일용매를 사용하면 분석시간이 길어지고 분리가 정확히 안된다

UV를 통해 컬럼에서 분리되는 시료의 흡광도를 측정한 뒤 정전기적 신호로 바꾸어 모니터링하게 해준다

다공성 물질인 실리카겔이 가장 활성화되기때문이다

비어-람베르트법칙

결정상수로써 1에 가까울수록 검량선과 일치하므로 신뢰성이 좋다, 1차방정식의 peak area미지시료의 면적값을 대입하여 정량화한뒤 농도를 알 수 있다.

디텍터에서 UV를 통해 흡광도를 측정한뒤 정전기적 신호로 바꿔주는데 이때 X축은 시간, Y축은 정전기적신호이다, 즉 시간이 지남에 따라 ampicillin의 흡광도를 측정해 정전기적신호로 바꾸어 Y축이 측정되는데 이때의 면적이 peak area이다

컬럼(고정상)에 있는 용매(이동상)들이 확산한다, 시료들의 분리가 일어난다, 용리력이 큰 용매 즉 상용성이 큰 용매는 시료가 빨리 빠져나가고, 용리력이 작은 용매 즉 상용성이 작은 용매는 시료가 느리게 빠져나간다, 즉 HPLC는 용리력차이로 인한 시료의 분리를 이용하는것이다

pump : 용매를 끌어 올려준다 -> 기포발생, degasser : 기포를 제거한다, auto sampler : 샘플을 주입해 컬럼으로 공급한다, column : 고정상으로 용리력차이에 의해 분리가 일어난다, detector : UV가 탑재되어 있어 컬럼에 의해 분리되어 들어오는 시료의 흡광도를 측정해 정전기적 신호로 바꾸어 모니터링을 하게 해준다