吸着

分配

質量分布比

シリカゲル、アルミナは吸着クロマトグラフィーのカラム充填剤として利用される。 また、吸着には脱吸着が可逆的な物理吸着が利用される。, 分配クロマトグラフィーは、順相クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーに大別される。また、順相クロマトグラフィーの固定相液体として水、メタノールなどの高極性溶媒を利用することができる。

固定相として ODS を用いた場合、通常、移動相にはメタノール、アセトニトリルなどの高極性溶媒が利用される。, シリカゲル並びに ODS は共に薄層クロマトグラフィーの固定相として利用される。

分配クロマトグラフィーは分離機構として、互いに混ざり合わない固定相と移動相に対する試料の分配係数の相違を利用したものである。, 分配クロマトグラフィーは順相クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーに大別される。

分配クロマトグラフィーにおける逆相クロマトグラフィーでは、化学結合型固定相としてオクタデシルシリル化シリカゲル(ODS)を利用することかできる。, 吸着クロマトグラフィー並びに分配クロマトグラフィーは、いずれも液体クロマトグラフィー(HPLC)および、ガスクロマトグラフィー(GC) の両者に利用可能である。

サイズ排除クロマトグラフィー並びにイオン交換クロマトグラフィーは，いずれもタンパク質、酵素、核酸などの精製に利用される。 , サイズ排除クロマトグラフィーでは通常、分子サイズ(分子量)が大きいほど早く溶出する。従って、アルブミンとグリシンの混合物をゲルクロマトグラフィーで分離した場合、アルブミンが最初に溶出する。

吸着クロマトグラフィーに利用される固定相にはシリカゲル、アルミナ等がある。 また、移動相にはヘキサン、ベンゼンのような低極性溶媒の他に気体も利用可能である。, 互いに混ざり合わない固定相と移動相に対する試料の分配係数の相違を利用した分離機構として分配があり、移動相には液体および気体が利用できる。, イオン交換クロマトグラフィー並びにサイズ排除クロマトグラフィーはともにタンパク質の精製に利用することができる。, 目的物質に対して生物学的親和性を示す物質（リガンド）を担体に固定したものを固定相に用い、親和性の差を利用して目的物質と不純物を分離する方法をアフィニティークロマトグラフィーという。また、リガンドと目的物質の組合せとして、酵素-基質、核酸-核酸、抗原－抗体などがある。

吸着クロマトグラフィーに利用される固定相にはシリカゲル、アルミナ等がある。 また、移動相にはベンゼンのような低極性溶媒の他に気体も利用可能である。, 移動相が気体、固定相が個体の場合、その分離機構は吸着が主となり、ガスクロマトグラフィーとして応用されている。, 互いに混ざり合わない固定相と移動相に対する試料の分配係数の相違を利用した分離機構として分配があり、移動相には液体および気体が利用できる。 , 移動相、固定相が、共に液体の場合、その分離機構は分配が主となり、液体クロマトグラフィー( HPLC )として応用されている。, ろ紙クロマトグラフィーは、ろ紙に含まれる水分を固定相とする分配クロマトグラフィーである。

ベンゼン、トルエン、安息香酸の順に溶出する。, 移動相中の緩衝液の含量を増加させても、ベンゼン、トルエン及び安息香酸の保持時間は変化しない。

陰イオン交換基として、三級アンモニウム基が用いられる。, 移動相の pH を下降させることで、保持された物質を溶出させることができる。

陽イオン交換基としては、スルホ基やカルボキシ基などが用いられる。, 移動相の pH を上昇させることで、保持された物質を溶出させることができる。

移動相の pH を上昇させることで、保持されたアミノ酸を溶出させることができる。, 溶出されたアミノ酸は、オルトフタルアルデヒドを用いた誘導体化法により、蛍光検出される。

理論段数 (N)

保持時間（tR）

ピーク面積, ピーク高さ

理論段高さ（H）, 理論段数（N）

理論段数（N）

シンメトリー係数(AS)

分離係数

熱伝導度検出器, 電子捕獲検出器, 水素炎イオン化検出器, 炎光光度検出器, 質量分析計

化学発光検出器, 紫外・可視吸光光度計, 蛍光検出器, 電気伝導度検出器, 電気化学検出器

炎光光度検出器

アルカリ熱イオン化検出器

化学発光検出器

分離係数( α )は、隣り合う２つのピークから計算された保持比を示すものであり、その値が 1 のとき、２つのピークの保持時間は完全に一致する。, ピークの対称性を示すものにシンメトリー係数(AS )があり、AS =1 のとき、ピークは左右対称であり、リーディングが認められる場合は AS <1 となる。

内標準法では被検成分と内標準物質のピーク面積比またはピーク高さ比を利用して定量を行う。, 絶対検量線法では、ピーク面積値およびピーク高さ値を定量に利用することができる。また、全測定操作を厳密に一定の条件に保って行う必要がある。, 内標準法に用いられる内標準物質にはそのピークが被検成分のピークになるべく近い保持時間をもち、試料中の他の成分ピークとも完全に分離する安定な物質を選ぶ。適当な内標準物質が得られない場合は絶対検量線法により定量を行う。

同一カラムについて、移動相の組成および流量を変化させると、保持時間及び分離度は変化する。, HPLC は液体試料および溶液にできる試料に適用され、その分離機構には吸着、分配、イオン交換、分子ふるいおよび生物学的親和性などが利用される。また検出器として蛍光光度計、質量分析計が利用できる。

試料の固定相および移動相に対する親和性を表す値として保持係数(k )があり、k が小さいほど試料が固定相に保持されにくい。, 分離度(Rs)は、ピーク相互の保持時間とピーク幅の関係を示すものであり、各成分が完全に分離しているときその値は 1.5 以上となる。, 保持時間は測定試料の注入時からピークの頂点が現れるまでの時間であり、同一条件下では物質に固有の値となり、保持時間から物質の確認を行うことができる。

ピーク面積値およびピーク高さ値は、同一条件下では、成分量と比例関係にあるので成分の定量に利用できる。, ピーク面積の測定法として半値幅法および自動積分法がある。, 同一カラムについて、移動相の組成および流量を変化させると、保持時間、分離係数、シンメトリー係数及び理論段数はいずれも影響を受ける。

カラムの理論段あたり高さ（H）は、移動相の流速の影響を受ける。, テーリングしたピークのシンメトリー係数 （AS）は、1.0 より大きい。

ピーク高さと保持時間が同じなら、ピーク幅が狭いほど理論段数（N ）は大きい。, 同一の分離条件で 2 つの化合物の保持時間が同じ場合、両者の分離係数(α)は 1 である。

目的成分を誘導体化した後にカラムに注入し、検出する方法をプレラベル法といい、試料をカラムで分離した後、溶出液中の目的成分を誘導体化し、検出する方法をポストラベル法という。, ニンヒドリン、o-フタルアルデヒドは、アミノ酸のラベル化試薬に利用される。

GC において利用できる分離機構は、吸着と分配である。, 固定相が固体の場合、その分離機構は吸着が主となる。また、固定相に液体を用いた場合、その分離機構は、分配が主となる。, 気体試料または気化できる試料に適用できる。また、不揮発性の物質でも、誘導体化することにより気化する物質に変換できれば本法により分析できる。

絶対検量線法による定量では、全測定操作を厳密に一定の条件に保って行う必要がある。 , 内標準法に用いられる内標準物質にはそのピークが被検成分のピークになるべく 近い保持時間をもち、試料中の他の成分ピークとも完全に分離する安定な物質を選ぶ。

GC では目的成分がカルボキシ基、水酸基等の官能基を有し、不揮発性の場合、適当な揮発性誘導体へと変換して分析を行うことができる。誘導体化法としてカルボキシ基に対してメチルエステル化、水酸基に対してアセチル化、トリメチルシリル化などがある。, カラム温度を変化させると試料ピークの保持時間は変化する。通常、カラム温度の上昇にともない保持時間は減少する。

移動相が気体であるため、固定相との吸着・分配平衡に達する時間が短く、高い分離能が得られる。

紫外吸光光度計

熱伝導度型検出器

紫外吸光光度計

ピーク面積の測定法として自動積分法を利用できる。, 定量には絶対検量線法が利用されている。

本法では試料溶液及び標準溶液を厳密に 10μL 注入する必要がない。, 水/メタノールの混合比を 1：1 に変えてもジドブジンの保持時間は変化しない。

移動相中のメタノールの割合を増やす

ピーク面積の測定法として自動積分法を利用できる。, 定量には絶対検量線法が利用されている。

C の移動相中のメタノール含量を増やすと、アセトアミノフェンの保持時間は短くなる。, E の条件をみたすとき、分離度が 1.5 以上であるので、２つのピークは完全分離している。

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ピーク面積の測定法として半値幅法及び自動積分法を利用できる。, 定量には内標準法が利用されている。

溶媒抽出法で弱酸性物質を抽出する場合、水相の pH をその pKa より高く調整し、有機溶媒中に抽出する。, 生体試料中のイオン性物質の抽出に、固相抽出法を利用することはできない。

水溶液中の目的物質を有機層に抽出するための有機溶媒として、ジエチルエーテルや 1-ブタノールなどが用いられる。, 水溶液中のタンパク質を不溶化し除去するために添加する有機溶媒として、アセトニトリルやメタノールが用いられる。

除タンパクには、タンパク質変性沈殿法、限外ろ過法などが用いられる。, 試料中の有機物の分解には、乾式灰化法、湿式灰化などが用いられる。

分析を妨害する目的成分以外の成分除去を目的に、試料前処理が必要となる場合があり、前処理法として溶媒抽出法、固相抽出法、除タンパク法などがある。, 生体試料の除タンパク法として過塩素酸、トリクロロ酢酸などの酸を利用する場合とエタノール、アセトニトリルなどの有機溶媒を利用する方法がある。, 生体試料溶液中の酸性化合物を有機溶媒相に抽出する場合、試料溶液を酸性とした後、有機溶媒抽出を行う。

固相抽出法は、吸着、分配、イオン交換等の分離モードを利用して試料からの目 的成分の抽出・精製を行う方法である。, 固相抽出法ではシリカゲル、オクタデシルシリル化シリカゲル並びにイオン交換体等を固相として利用することができる。, 一般に、固相抽出法の抽出効率は、溶媒抽出法に比べて優れている。, 固相抽出法の利点の一つは、多数検体の迅速処理が可能な点である。

水溶液中の目的成分を有機層に抽出するための有機溶媒として一般に、クロロホルム、酢酸エチルなどの水と混じり合わない溶媒が利用される。, 水溶液中の目的成分を有機層に効率的に抽出するために塩化ナトリウムなどの無機塩を水相に添加する場合がある。, 水溶液中の目的成分を一定量の有機溶媒で抽出する場合、一回の抽出率が低い場合であっても、複数回の抽出操作を行うことにより抽出量を増やすことができる。

飽和炭酸水素ナトリウム水溶液

溶媒抽出法において、水溶液中の目的成分が弱塩基性物質の場合、水溶液を酸性に調整すると有機溶媒中に抽出されやすくなる。, 溶媒抽出法において、水溶液中の目的成分を有機層に抽出するための有機溶媒としてメタノールやアセトニトリルが用いられる。